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糖基化反應(yīng)條件對豌豆蛋白乳化特性的影響

發(fā)布時(shí)間 : 2022.12.02

豌豆蛋白低聚木糖糖基化乳化活性乳化穩(wěn)定性

試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用濕法糖基化方法，將豌豆蛋白與XOS按一定的質(zhì)量比溶解于蒸餾水中，并保持蛋白濃度為1%，磁力攪拌2h混勻，調(diào)節(jié)pH值為7，于4℃冰箱中放置過夜，使其充分水合。將樣品放置在75℃水浴鍋中反應(yīng)90min，取出在冰水中冷卻5min，以終止反應(yīng)，得到糖基化產(chǎn)物。
測定糖基化產(chǎn)物的乳化特性：取15mL糖基化樣品溶液，加入5mL大豆油混合后進(jìn)行剪切（室溫（25℃）、12000r/min、2min）處理。剪切處理后分別在0、10min從底部取樣50μL，加入5mL0.1%SDS，測定500nm處的吸光值，以SDS溶液為空白。乳化特性以乳化活力指數(shù)（EAI）表示，計(jì)算公式如下。

式中：EAI是每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2/g；A500為500nm處的吸光值；N是稀釋倍數(shù)；Φ是體系中油相所占體積分?jǐn)?shù)；C是蛋白質(zhì)的濃度，g/mL；L是比色皿光徑，1cm。
乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)表示，計(jì)算公式如下。

式中：A0為0min的吸光值；A10為10min的吸光值。
調(diào)節(jié)溶液pH值分別為7.0，反應(yīng)溫度為70℃，控制糖基化反應(yīng)時(shí)間為90min，調(diào)控豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比分別為1︰1、2︰1、3︰1、4︰1，測定不同豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。調(diào)節(jié)溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，糖基化反應(yīng)時(shí)間為90min，調(diào)控反應(yīng)溫度分別為70、80、90、100℃，測定不同反應(yīng)溫度下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。調(diào)節(jié)溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，，反應(yīng)溫度為80℃，調(diào)控糖基化反應(yīng)時(shí)間分別為30、60、90、120min，測定不同反應(yīng)時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的乳化特性。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比3個(gè)因素為自變量，以產(chǎn)物的乳化特性為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究各自變量及其交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，進(jìn)一步優(yōu)化XOS糖基化豌豆蛋白改性工藝的最佳參數(shù)。設(shè)計(jì)類型為三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中5個(gè)為中心試驗(yàn)，12個(gè)為析因試驗(yàn)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合及方差分析，試驗(yàn)因素水平如表1所示。采用SPSS20、Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、作圖及顯著性分析，顯著性水平設(shè)為0.05。采用DesignExpert8.0.6軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

試驗(yàn)結(jié)果
（1）豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比對豌豆蛋白乳化特性的影響
在豌豆蛋白濃度為1%，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為90min時(shí)，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比對糖基化反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨著豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比的增加，豌豆蛋白糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在一定的豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比下，溶液黏性可使糖分子與蛋白質(zhì)分子接觸機(jī)會(huì)增大，糖基化反應(yīng)順利進(jìn)行；XOS附著在蛋白質(zhì)表面增加了空間位阻，因此油滴不易聚集和凝結(jié)，從而表現(xiàn)出糖基化產(chǎn)物乳化活性和乳化穩(wěn)定性提高。當(dāng)糖分子過多，溶液黏性隨之增加，反而不利于糖基化反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致乳化特性較差。可見適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)與糖的質(zhì)量比有利于獲得乳化特性較好的糖基化產(chǎn)物。因此，確定豌豆蛋白與XOS的質(zhì)量比為2:1，此時(shí)糖基化產(chǎn)物具有高的乳化特性，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為10.34m2/g和61.75%。
（2）反應(yīng)溫度對豌豆蛋白乳化特性的影響
在豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，反應(yīng)時(shí)間為90min時(shí)，反應(yīng)溫度對糖基化反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性的影響見圖2。

由圖2可知，整體上，隨著反應(yīng)溫度的升高，糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度在80℃時(shí)，糖基化產(chǎn)物具有較好的乳化特性(乳化活性12.3m2/g，乳化穩(wěn)定性70.15%)，不同反應(yīng)溫度的乳化穩(wěn)定性無顯著性差異，故以乳化活性最高為最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)溫度是影響糖基化反應(yīng)進(jìn)程的一個(gè)重要指標(biāo)，適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，使蛋白質(zhì)變性伸展，多肽鏈被解聚成小分子肽和游離氨基酸，加快了糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合，使乳化活性升高；溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，不利于糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合。
（3）反應(yīng)時(shí)間對豌豆蛋白乳化特性的影響
當(dāng)豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比為2︰1，反應(yīng)溫度為70℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對糖基化反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖3所示。

由圖3可知，在0～120min的反應(yīng)時(shí)間段，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，糖和蛋白質(zhì)不斷結(jié)合，乳化活性隨之提高，而反應(yīng)時(shí)間過長，更多的親水性糖分子附著在豌豆蛋白上，這會(huì)相應(yīng)地降低乳化活性。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60min時(shí)，糖基化產(chǎn)物具有較好的乳化活性，乳化穩(wěn)定性無顯著變化，此時(shí)乳化活性為11.83m2/g；乳化穩(wěn)定性為56.20%。
（4）最佳反應(yīng)條件的確定
在反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比（C）單因素研究的基礎(chǔ)上，以乳化特性（乳化活性和乳化穩(wěn)定性）為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案，具體設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。同時(shí)對結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果如表3和表4所示。

以溫度（A）、時(shí)間（B）、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比（C）為自變量，通過對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析得到乳化活性（Y1）、乳化穩(wěn)定性（Y2）和反應(yīng)條件之間的二次多項(xiàng)式回歸方程分別為Y1=-23.56704+0.69245A+0.10712B+4.84350C-0.000305AB-0.006AC-0.0177BC-0.004315A2-0.0003064B2-0.651C2，R2=0.9621；Y2=-65.16468+2.26480A+ 0.72166B+0.72166C-0.0045625AB+0.14587AC-0.11115BC-0.014364A2-0.0007863 B2-2.93575C2，R2=0.9677。其中，由模型擬合F檢驗(yàn)值可知，乳化活性F=19.72，P值=0.0004<0.01，乳化穩(wěn)定性F=23.29，P值=0.0002<0.01，說明該模型擬合性較好，達(dá)到顯著水平；同時(shí)，失擬項(xiàng)：乳化活性F=3.31，P值=0.1391>0.05，乳化穩(wěn)定性F=1.67，P值=0.3095>0.05，模型失擬性檢驗(yàn)不顯著。去掉對乳化活性影響不顯著的交互因素AB、AC后模型R2=0.9485、調(diào)整R2=0.9085、預(yù)測R2=0.7728、變異系數(shù)=4.02。對于乳化穩(wěn)定性模型R2=0.9677、調(diào)整R2=0.9261、預(yù)測R2=0.6901、變異系數(shù)=2.93。結(jié)果表明該模型擬合度好，可以很好地對響應(yīng)值（乳化特性）進(jìn)行預(yù)測。

由表3和表4得到的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可得，選取的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比3個(gè)因素對豌豆蛋白糖基化復(fù)合物的乳化特性有重要影響。對一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小排序，可得乳化活性中3個(gè)因素的影響順序?yàn)镃＞A＞B，乳化穩(wěn)定性3個(gè)因素的影響順序?yàn)镃＞B＞A。此外，交互作用中，一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)BC，二次交互項(xiàng)A2、B2對改性豌豆蛋白乳化活性影響極顯著，二次項(xiàng)C2影響顯著。一次項(xiàng)B、C，交互項(xiàng)AB、AC、BC，二次交互項(xiàng)A2、、C2對改性豌豆蛋白乳化穩(wěn)定性影響極顯著，二次項(xiàng)B2影響顯著。這說明各因素對糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響不是簡單的線性關(guān)系。
為進(jìn)一步研究各因素之間交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，用Design-Expert8.0.6進(jìn)行各因素之間的交互作用響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖4和圖5所示。
圖4直觀反映出蛋白-糖比例和反應(yīng)時(shí)間對豌豆蛋白乳化活性的影響，當(dāng)豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比固定時(shí)，乳化活性隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈先升高后降低的趨勢；圖5直觀反映出各影響因素交互作用對乳化穩(wěn)定性的影響，當(dāng)豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比不變時(shí)，乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。

（5）最佳工藝條件驗(yàn)證
試驗(yàn)表明，豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間均可影響糖基化反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)而影響糖基化產(chǎn)物乳化特性的變化。采用Design-Expert8.0.6進(jìn)行模型預(yù)測，預(yù)測工藝條件為反應(yīng)溫度74.63℃、反應(yīng)時(shí)間93.65min、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比1.86︰1，預(yù)測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.13m2/g、乳化穩(wěn)定性為60.44%。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件，在反應(yīng)溫度75℃、反應(yīng)時(shí)間90min、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比2︰1條件下測得乳化活性為12.32m2/g、乳化穩(wěn)定性為59.64%，調(diào)整后預(yù)測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.19m2/g、乳化穩(wěn)定性為60.16%。可見，實(shí)際值與預(yù)測理論值接近，說明此模型優(yōu)化結(jié)果可靠。

試驗(yàn)結(jié)論
本試驗(yàn)以豌豆蛋白與XOS為原料，采用濕法糖基化方法制備豌豆蛋白-XOS復(fù)合物。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法建立糖基化復(fù)合物制備條件（豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間）的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)回歸方程分析及預(yù)測模型，得到最佳制備工藝條件。整體上，模型擬合度好，可以很好地對反應(yīng)過程中豌豆蛋白乳化特性進(jìn)行預(yù)測。這3個(gè)因素對豌豆蛋白乳化活性影響大小為豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間；對乳化穩(wěn)定性影響大小為蛋白-糖比例＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度。最佳工藝條件為反應(yīng)溫度75℃、反應(yīng)時(shí)間90min、豌豆蛋白與XOS質(zhì)量比2︰1，測得乳化活性為12.32m2/g、乳化穩(wěn)定性為59.64%。該研究將為豌豆蛋白在乳液體系中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考資料：

馬露燕,郭興鳳,朱婷偉,田亞東,段曉杰.糖基化反應(yīng)條件對豌豆蛋白乳化特性的影響[J/OL].食品研究與開發(fā):1-10[2022-10-21].http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1231.ts.20221009.1716.004.html