試驗設(shè)計 選擇24只6周齡的雄性Wistar大鼠，體重200-250克，所有的大鼠都被安置在一個溫度為25±1°C的房間里，光照/黑暗周期為12小時，并接受特定的食物和水自由；首先，大鼠被隨機分為兩組，分別為正常飲食組（ND）和高脂飲食組（HF）（每組12只），ND組大鼠使用標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料（19.77%的能量來自脂肪，能量含量為4.02千卡/克），HF組大鼠使用包括59.28%的能量來自脂肪，能量含量為5.35千卡/克的飲食來誘導(dǎo)肥胖；12周后，大鼠被細分為四組（n=6/組），具體如下：（i）正常飲食（ND）；（ii）用XOS處理的正常飲食（NDX）；（iii）高脂飲食（HF）和（iv）用XOS處理的高脂飲食（HFX）；XOS在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的濃度為1000 mg/mL，每天口服灌胃1 ml含XOS的PBS，持續(xù)12周，ND和HF大鼠接受無菌的PBS作為載體對照；在第24周結(jié)束時，收集大鼠的血液和尿液，所有大鼠都被吸入異氟烷麻醉，并被處死，處死后立即摘除腎臟，去囊并稱重，一個腎臟被用來通過檢測硫酸雌酮（ES）在腎皮質(zhì)切片中的攝取量來確定轉(zhuǎn)運體Oat3的功能，另一個腎臟用于通過Western blot分析確定蛋白質(zhì)的表達，丙二醛（MDA），蘇木精和伊紅（H&E）染色進行形態(tài)分析和TUNEL檢測，組織樣本保存在-80℃，用于后續(xù)研究。 血液和尿液的化學(xué)成分檢測：禁食5-6小時后，用異氟烷對大鼠進行麻醉，從尾部側(cè)靜脈采集血樣，測定血漿葡萄糖、總膽固醇的濃度、血漿胰島素及血清肌酐水平；對于尿液分析，將動物放置在代謝籠中，以便能夠24小時收集尿液，記錄24小時內(nèi)的攝水量和尿量，使用自動生化分析儀測量尿液肌酐和微量白蛋白，并通過肌酐清除率測量腎小球濾過率。 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）：在第24周進行，將大鼠禁食12小時后，給大鼠灌胃葡萄糖溶液（2克/公斤體重），攝入葡萄糖15、30、60和120分鐘后，對大鼠進行麻醉，收集血樣以測量血漿葡萄糖水平，每個時間間隔的血漿葡萄糖以OGTT的曲線表示，并計算曲線下的總面積（AUC）。 組織學(xué)檢查：將大鼠腎臟沿橫軸切成兩半，固定在10%的中性緩沖福爾馬林中，并嵌入石蠟，將石蠟包埋的標(biāo)本切成2微米厚的切片，安裝在顯微鏡載玻片上，用蘇木精和伊紅（H&E）染色，進行一般組織學(xué)評估，并在光學(xué)顯微鏡下檢查樣本，以觀察是否存在腎小管和腎小球的變化。 腎臟Oat3功能的測定：腎臟Oat3功能用腎皮質(zhì)切片攝取法進行評估；腎臟被摘除并放入新鮮的含氧、冰冷、改良的Cross和Taggart鹽水緩沖液（包含：95 mM NaCl，80 mM甘露醇，5 mM KCl，0.74 mM CaCl2和9.5 mM Na2HPO4，pH7.4），用Stadie-Riggs切片機切割腎皮質(zhì)薄片（≤0.5毫米；5-25毫克，濕重）；將組織切片在含或不含胰島素（30 μg/mL）的緩沖液中預(yù)培養(yǎng)30分鐘，然后在室溫下在含有50 nM [3H]硫酸雌酮（ES）（[3H]ES; Perkin Elmer）的1 mL緩沖液中培養(yǎng)30分鐘；培養(yǎng)后，組織切片用0.1 M MgCl2清洗，在濾紙上吸干，稱重并溶解在0.4 mL的1 M NaOH中，然后用0.6 mL的1 M HCl中和組織中的NaOH，使用液體閃爍分析儀（Perkin Elmer）測量放射性，[3H]ES進入腎臟皮質(zhì)組織的運輸量被計算為對照組的百分比。 腎臟皮質(zhì)組織中的脂質(zhì)過氧化（MDA水平）：為了測定腎臟的氧化應(yīng)激，對腎臟皮質(zhì)組織中的丙二醛（MDA）進行測定，根據(jù)制造商的協(xié)議，將腎皮質(zhì)組織分離出來，在含有1%蛋白酶抑制劑（羅氏應(yīng)用科學(xué)）的CelLytic MT哺乳動物組織裂解/提取試劑（Sigma Aldrich）中懸浮并均質(zhì)，然后在4℃下以1600 g離心10分鐘，收集上清液并使用商業(yè)硫代巴比妥酸測定（TBAR測定）試劑盒（開曼化學(xué)公司）來測定腎皮質(zhì)MDA。 終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的UTP缺口標(biāo)記（TUNEL）測定：使用Calbiochem DNA碎片檢測試劑盒（Millipore）檢測石蠟包埋的腎臟組織切片中的凋亡細胞，通過終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）與響應(yīng)凋亡信號產(chǎn)生的DNA片段的暴露3′-OH末端結(jié)合，TdT催化了生物素標(biāo)記的和未標(biāo)記的脫氧核苷酸的加入，使用鏈霉蛋白-辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物檢測生物素化的核苷酸，二氨基聯(lián)苯胺與標(biāo)記的樣品反應(yīng)，在DNA斷裂的部位（TUNEL陽性細胞）生成不溶性的棕色底物，在光學(xué)顯微鏡下檢查和計算該底物。 西方印跡分析：為了分析蛋白質(zhì)的表達，將0.1克腎皮質(zhì)組織樣品在含有1%蛋白酶抑制劑混合物（羅氏應(yīng)用科學(xué)）的裂解緩沖液（Sigma Chemical）中勻漿，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；將蛋白樣品與加載緩沖液混合，在95℃下加熱10分鐘，進行12%的SDS-PAGE，隨后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜（Millipore）；非特異性蛋白用5%的非脂干乳在Tris-緩沖鹽水（TBS）或含有0.1% Tween-20的PBS在室溫下阻斷1小時，然后用CosmoBio有限公司的腎臟Oat3的特異性抗體（KAL-KE035）在4℃下培養(yǎng)過夜；蛋白質(zhì)水平以β-肌動蛋白或GAPDH作為加載對照進行標(biāo)準(zhǔn)化；用緩沖液清洗三次，每次5分鐘，然后用第二抗體孵育1小時，再用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（Bio-Rad實驗室）孵育5分鐘；使用ChemiDoc Touch成像系統(tǒng)（Bio-Rad實驗室）對蛋白帶強度進行成像，并使用Image J（Adobe）進行分析。 試驗結(jié)果 （1）補充XOS前后的代謝和腎臟參數(shù) 由表1可知，與正常飲食喂養(yǎng)的大鼠相比，高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠在食物和能量攝入、體重和總膽固醇水平方面都顯著增加；在ND（對照組）和HF大鼠之間，空腹血糖水平?jīng)]有顯著差異；然而，與ND對照組大鼠相比，HF大鼠的血漿胰島素水平顯著增加（P<0.05），表明HF大鼠存在胰島素抵抗情況，且攝水量、尿量、尿肌酐、血清肌酐和肌酐清除率在HF大鼠中沒有變化；但與ND大鼠相比，HF大鼠的微量白蛋白尿有顯著增加（P<0.05）；以上結(jié)果表明，在高脂飲食喂養(yǎng)12周后，HF大鼠的腎功能出現(xiàn)了損害。
由表2可知，補充XOS 12周后的HF飲食大鼠即HFX大鼠，與HF大鼠相比，其食物和能量攝入、體重、總膽固醇和血漿胰島素水平都有顯著的下降（P＜0.05）；圖1A結(jié)果顯示，與ND大鼠相比，HF大鼠在攝入葡萄糖60和120分鐘后，血漿葡萄糖水平顯著升高（P<0.05）；圖1B結(jié)果顯示，HF大鼠在OGTT期間葡萄糖升高，反映其出現(xiàn)葡萄糖不耐受，這些結(jié)果與HF組的曲線下總面積（AUC）的增加相關(guān)；以上數(shù)據(jù)表明，HF大鼠在本研究中出現(xiàn)了胰島素抵抗；用XOS處理HF大鼠后，與未處理的HF大鼠相比，這種情況顯著改善（P<0.05）；與HF大鼠相比，HFX大鼠的尿液微量白蛋白水平顯著下降（P<0.05）；與未經(jīng)處理的HF大鼠相比，XOS的攝入也使HFX大鼠肌酐清除率顯著增加（P<0.05），腎臟功能有所改善；此外，與ND大鼠相比，HF大鼠的腎臟重量與體重的比值顯著下降（P<0.05）；與HF大鼠相比，在HFX大鼠中補充XOS不能增加腎臟重量與體重的比值。然而，在NDX大鼠中，補充XOS的代謝和腎功能參數(shù)與對照組相比沒有顯著的差異。
（2）XOS處理對腎功能和腎臟Oat3功能的影響 如圖2A所示，與對照組相比，HF飲食大鼠表現(xiàn)出腎功能受損，表現(xiàn)為微量白蛋白尿的顯著增加和肌酐清除率的下降（P<0.05）；與HF相比，HFX的XOS處理可以改善這些損傷（P<0.05）；與ND對照組大鼠相比，HF大鼠腎皮質(zhì)組織對[3H]ES的攝取顯著減少，反映出大鼠腎臟Oat3功能的受損（P<0.05）；圖2B和圖2C顯示，與ND大鼠相比，HF大鼠的腎臟Oat3功能下降與腎皮質(zhì)組織的全細胞裂解液和膜部分的Oat3表達下降有關(guān)（P<0.05）；與HF大鼠相比，HFX大鼠的XOS處理使[3H]ES攝取量顯著增加（P<0.05），這些結(jié)果與HFX大鼠全細胞和膜部分的Oat3表達量顯著增加有關(guān)（P<0.05）。
（3）XOS處理對腎臟形態(tài)學(xué)和足細胞損傷的影響 如圖3A所示，高脂飲食大鼠的腎臟組織學(xué)，包括鮑曼囊和胞間隙的擴大、腎小球的萎縮和細胞脫落到腎小管腔內(nèi)與腎功能的下降相關(guān)；圖3B顯示了這些變化被分級并報告為腎臟損傷的評分。 如圖3C和圖3D所示，HF組的腎臟損傷評分顯著高于對照組，用XOS處理后，HF大鼠表現(xiàn)出腎臟形態(tài)得以改善，損傷評分下降；此外，與ND組相比，HF組的足細胞nephrin和podocin的表達顯著下降（nephrin和podocin：主要裂孔隔膜蛋白分子，維持足細胞結(jié)構(gòu)和功能，其表達改變是足細胞損傷的重要標(biāo)志）（P<0.05），以上結(jié)果表明，足細胞損傷與HF大鼠尿液中微量白蛋白的增加有關(guān)，且這些蛋白質(zhì)在HF組表達水平的下降被XOS處理后恢復(fù)。
（4）XOS處理對腎臟氧化應(yīng)激的影響 如圖4所示，與ND大鼠相比，HF大鼠腎皮質(zhì)的MDA水平和4-HNE的表達顯著增加（P<0.05）；與HF大鼠相比，HFX大鼠補充XOS后，MDA水平和4-HNE的表達顯著下降（P<0.05）；如圖5所示，與ND大鼠相比，HF大鼠的AT1R、NOX4和NOX2的組成部分p67phox的表達顯著增加（P<0.05），這些刺激在HFX大鼠中被XOS處理所抑制（P<0.05）；此外，與ND大鼠（P<0.05）相比，HF大鼠的PKCα磷酸化水平顯著增加（P<0.05）；圖6A結(jié)果顯示，Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子在全細胞裂解液中的表達在所有實驗組中沒有表現(xiàn)出顯著差異；圖6B結(jié)果顯示，與ND大鼠相比，HF大鼠中細胞核中的Nrf2有顯著增加（P<0.05）；圖6C和圖6D結(jié)果顯示，在HF大鼠中也發(fā)現(xiàn)Keap1和Erk1/2有顯著增加，表明Keap1與Nrf2的分離和Nrf2向細胞核的轉(zhuǎn)移增加將促進抗氧化酶的產(chǎn)生；圖6E和圖6F結(jié)果顯示，與ND大鼠相比，HF大鼠的抗氧化酶包括SOD2和GCLC的水平顯著增加（P<0.05）；與HF大鼠相比，XOS處理HFX大鼠表現(xiàn)出削弱了SOD2和GCLC的表達（P<0.05）。
（5）XOS處理對腎臟細胞凋亡的影響 如圖7A所示，HF大鼠的組織呈現(xiàn)出TUNEL陽性細胞或DNA分裂的證據(jù)（如箭頭所示的深棕色），而ND大鼠沒有這樣的證據(jù)；圖7B結(jié)果顯示，與ND大鼠相比，HF大鼠的TUNEL陽性細胞顯著增多，而XOS處理導(dǎo)致了TUNEL陽性細胞的數(shù)量減少；圖7C結(jié)果顯示，與ND大鼠相比，HF大鼠中促凋亡蛋白Bax的表達顯著增加（P<0.05）；然而圖7D結(jié)果顯示，當(dāng)ND和HF大鼠比較時，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達沒有顯著變化，HFX大鼠的XOS處理盡管沒有導(dǎo)致Bcl-2表達的增加，但導(dǎo)致Bax蛋白的表達減少（P<0.05）；圖7E結(jié)果顯示，Bax/Bcl-2的表達比值證實，與ND大鼠相比，HF大鼠的細胞凋亡顯著增加（P<0.05）；與HF大鼠相比，用XOS處理可以降低Bax/Bcl-2的比率（P<0.05），表明XOS可以恢復(fù)HFX大鼠由腎臟細胞凋亡造成的損害。
試驗結(jié)論 總之，補充XOS能夠改善HF大鼠出現(xiàn)的體重和胰島素抵抗顯著增加、足細胞損傷、微量白蛋白尿增加、肌酐清除率下降和Oat3功能受損現(xiàn)象，且XOS處理后，腎臟MDA水平和AT1R、NOX4、p67phox、4-HNE、磷酸化PKCα和ERK1/2的表達都顯著下降；此外，Nrf2-Keap1通路、SOD2和GCLC的表達以及腎臟的凋亡也被XOS顯著抑制，表明XOS可以通過調(diào)節(jié)AT1R-PKCα-NOXs通路的激活，來減少氧化應(yīng)激和細胞凋亡，間接恢復(fù)肥胖胰島素抵抗大鼠的腎功能和Oat3功能，改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型中的腎臟功能紊亂。
參考資料： Keerati W ,Sakawdaurn Y ,Wannipa T , et al.Prebiotic prevents impaired kidney and renal Oat3 functions in obese rats.[J].The Journal of endocrinology,2018,237(1):29-42. |
