 試驗設計 β-乳球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備：準確稱取若干份相同質(zhì)量β-LG樣品，調(diào)節(jié)低聚木糖和β-LG的質(zhì)量比依次為2：1，4：1，6：1，8：1，10：1；溶于一定濃度的pH值為7.3的PBS緩沖液中，控制水浴溫度55℃，處理時間8 h的條件下進行反應，冰浴10 min終止反應，4℃儲存，備用。未加入低聚木糖的β-LG同處理做對照。 β-乳球蛋白糖基化反應程度的測定：取0.125 mL糖基化溶液，加入5 mL質(zhì)量濃度為0. 1 g/100 mL的SDS溶液，渦旋振蕩混勻，從中取0.250 mL加入到盛有2 mL PBS緩沖液（濃度0.05 mol/L，pH值為8.2）的試管中，再加入1 mL質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL的TNBS溶液，渦旋振蕩混勻，在50℃水浴中避光反應1 h，然后取出加入2 mL濃度為0.1 mol/L的HCI終止反應，室溫下放置30 min，于340 nm波長處測定吸光度。按公式計算接枝度：DG/%=(A0-At)/A0x100，式中：A0為接枝反應前樣品的吸光度；At為反應t時刻后樣品的吸光度。 接枝物褐變度的測定：取0.125 mL糖基化后溶液，加入5 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的SDS溶液，渦旋振蕩混勻在420 nm波長處測定吸光度，以0.1 g/100 mL SDS溶液做空白對照。 糖基化產(chǎn)物的功能性質(zhì)的測定： (1)溶解度的測定：取等量糖基化β-乳球蛋白產(chǎn)物用濃HCI或濃NaOH將溶液的pH值調(diào)配為3.0，5.0，7.0，9.0，然后將樣品于15000 g下離心15 min；在上清液中蛋白質(zhì)的含量以牛血清白蛋白做標準用考馬斯亮藍G-250法進行測定；溶解度為上清液中蛋白質(zhì)含量與總蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的比；所有實驗操作均在室溫下進行。 (2)乳化性和乳化穩(wěn)定性測定：取5 mL糖基化產(chǎn)物分別溶于pH值為3.0，5.0，7.0和9.0磷酸鹽緩沖液，加入5 mL玉米油，用數(shù)字均質(zhì)儀在24000 r/min下均質(zhì)1 min后，立即取50 μL底部的乳化液用體積分數(shù)為0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液按1：100的體積比稀釋，5 s渦旋后，在500 nm處測稀釋后的乳化液的吸光度。乳化性用吸光值表示，乳化穩(wěn)定性(ES)為ES=10A0/(A0-A10)式中：A0和A10分別是在0 min和10 min時測得的稀釋后的乳化液的吸光度，所有操作至少3次。 (3)起泡性測定：取30 mL的糖基化產(chǎn)物溶液，在室溫下于均質(zhì)機中均質(zhì)1 min，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，然后快速地移至100 mL量筒內(nèi)，記錄泡沫的體積表示為起泡能力，該操作平行5次。 試驗結(jié)果 （1）蛋白接枝度 由圖1可知，在加熱溫度、時間及pH值大小等其他因素相同時，隨著低聚木糖與β-乳球蛋白比例升高，接枝度和褐變度都呈先升高后降低的趨勢，在6：1時的接枝度最大，達到28.1%，此結(jié)果表明了6：1比例的糖基化反應中糖基化程度最高，糖基的結(jié)合度最大并驗證了不同配比的糖基化反應中糖基與β-乳球蛋白的結(jié)合。
由圖2可知，在質(zhì)量比為2：1，4：1，6：1，8：1，10：1的糖蛋白比例時，pH值分別為3.0，5.0，7.0，9.0時的溶解度都呈先減小再增大的趨勢；在pH值為5附近的溶解度最小。隨著低聚木糖質(zhì)量比例的增加，修飾后β-乳球蛋白的溶解度有增加的趨勢，普遍都比未被修飾的β-乳球蛋白溶解度高；當?shù)途勰咎桥cβ-乳球蛋白的糖蛋白配比為8：1時，修飾后蛋白溶解度已經(jīng)得到明顯的提高，糖蛋白比例繼續(xù)增加到10：1時溶解度的改善程度變化不大。  由圖3和圖4可知，當糖的比例逐漸增加時，糖基化產(chǎn)物的乳化性是先升高后降低，結(jié)果表明蛋白質(zhì)和還原糖的質(zhì)量比直接影響了糖基化反應的進程；β-乳球蛋白與低聚木糖質(zhì)量比例為6∶1時候乳化性及乳化穩(wěn)定性最好，乳化性比對照組β-乳球蛋白高出40.2%。
由圖5可知，低聚木糖的糖基化修飾對β-乳球蛋白的起泡性能有促進作用，是因為泡沫的形成的最重要的因素是蛋白質(zhì)的吸附率，促進蛋白質(zhì)展開，疏水基團暴露，使得吸附率增加，所以β-乳球蛋白泡沫性能略有增加；但是在其他條件相同的情況下，糖基化反應中的低聚木糖和β-乳球蛋白配比對起泡性并無顯著影響。
總之，本文使用低聚木糖修飾β-乳球蛋白研究β-乳球蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6：1糖蛋白配比時，β-乳球蛋白和低聚木糖的糖基化反應接枝度最高為28.1%；10：1的糖蛋白配比時，改善β-乳球蛋白的溶解性最好，相比于天然β-乳球蛋白溶解性最大提高了71.4%；6：1的糖蛋白配比時，改善β-乳球蛋白的乳化性及穩(wěn)定性最好，乳化性比天然β-乳球蛋白高出40.2%，但是糖蛋白配比對起泡能力并無顯著影響。 涂越，劉偉，鐘俊楨，劉成梅，徐雨佳. 低聚木糖修飾對牛乳β-乳球蛋白功能性質(zhì)的影響[J].中國乳品工業(yè)，2012，40(12)：12-15. |
