試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)材料：玉米芯中提取的XOS（純度>90%）；植物乳桿菌菌株Lb1, B72, QH25-1, C88, Sc52, YNF-5, S62, S2, S56和Ml 12-2-2；細(xì)菌病原菌是大腸桿菌CMCC44825、傷寒沙門氏菌CMCC50115、福氏志賀氏菌CMCC51061和金黃色葡萄球菌CMCC2607。 XOS對(duì)植物乳桿菌的益生元活性：將50 μL植物乳桿菌菌株（Lb1, B72, QH25-1, C88, Sc52, YNF-5, S62, S2, S56和Ml 12-2-2）的過夜培養(yǎng)物（1×106 CFU/mL）接種到不同的試驗(yàn)介質(zhì)中，在37℃厭氧培養(yǎng)12 h，測(cè)定每隔2 h的OD600來評(píng)估菌株生長(zhǎng)。陰性對(duì)照組培養(yǎng)基中無碳水化合物，陽性對(duì)照組培養(yǎng)基含有0.5%（w/v）葡萄糖，試驗(yàn)組在無碳水化合物培養(yǎng)基中加入0.5%（w/v）XOS。 短鏈脂肪酸分析：采用氣相色譜（GC）方法測(cè)定發(fā)酵液的上清液樣品（2.0 mL）中短鏈脂肪酸SCFA（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸和乳酸）的濃度。 抗菌活性：采用孔擴(kuò)散法檢測(cè)XOS發(fā)酵的無細(xì)胞植物乳桿菌S2上清液的抗菌活性。將植物乳桿菌S2菌株經(jīng)MRS肉湯培養(yǎng)基（含0-6 g/L XOS）發(fā)酵后得到的無細(xì)胞上清液倒入在涂有測(cè)試病原體（大腸桿菌CMCC44825、傷寒沙門氏菌CMCC50115、福氏志賀氏菌CMCC51061和金黃色葡萄球菌CMCC2607）的LB瓊脂板上制作的8 mm孔中，在37℃厭氧條件過夜培養(yǎng)，測(cè)量孔周圍的抑制區(qū)的直徑，直徑8 mm表示無抗菌活性（-）；直徑0~3 mm表示弱抗菌活性（+）；直徑3~6 mm表示較好抗菌活性（++）；直徑>6 mm表示強(qiáng)抗菌活性（++）。 對(duì)小鼠模型中腸道菌群的調(diào)節(jié)作用：第1組對(duì)照組喂食0.4 mL PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）; 第2組小鼠喂食0.4 mL含5.0 g/L XOS的PBS；第3組小鼠喂食0.4 mL含5.0 g/L XOS與0.4 mL細(xì)胞濃度為1.0×109 CFU/ mL的植物乳桿菌S2混合物的PBS，三組分別喂食14天，再給小鼠喂食基礎(chǔ)飲食7天。在0、7、14、16和21天時(shí)，收集每組中小鼠直腸的新鮮糞便樣本，評(píng)估活的乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌屬、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量。 體外抗氧化活性的測(cè)定：采用分光光度法測(cè)定XOS樣品（0.5-4 mg/mL），其中含有相同體積的植物乳桿菌S2（1010 CFU/ mL），其2,2-二苯基-1-苦基肼自由基清除能力、清除ABTS自由基的活性，以及對(duì)亞鐵離子的螯合作用。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）益生元活性 如表1所示，試驗(yàn)中被測(cè)試的所有植物乳桿菌菌株都很容易利用來自玉米芯的XOS，且當(dāng)采用0.5 g/L XOS培養(yǎng)時(shí)，所有物乳桿菌菌株的OD600在發(fā)酵12 h后都超過0.6，其中植物乳桿菌S2的生長(zhǎng)受XOS的益生作用最大。
（2）短鏈脂肪酸 如表2所示，在所有接種XOS作為碳源的培養(yǎng)基中，植物乳桿菌菌株在發(fā)酵12 h后，植物乳桿菌S2產(chǎn)生的總有機(jī)酸濃度最高（5.64 mg/mL），而植物乳桿菌 B72產(chǎn)生的最低（4.42 mg/mL），且乙酸是產(chǎn)生的主要短鏈脂肪酸，而植物乳桿菌S2產(chǎn)生的乙酸和乳酸量最高（分別為1.78和2.18 mg/mL），因此結(jié)合發(fā)酵和短鏈脂肪酸譜的結(jié)果，選擇植物乳桿菌S2進(jìn)行進(jìn)一步研究。
（3）XOS的抗菌作用 如表3所示，在MRS肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的植物乳桿菌S2對(duì)四種病原菌有強(qiáng)大的抑制作用；在MRS肉湯培養(yǎng)基中加入XOS后，植物乳桿菌S2對(duì)四種病原菌的抗菌活性顯著增加，且對(duì)福氏志賀氏菌和大腸桿菌的抗菌活性比金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗菌活性強(qiáng)，以上結(jié)果表明XOS促進(jìn)了無細(xì)胞上清液中有益菌的增殖，增加了抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。 （4）腸道微生物群的調(diào)控 如圖1所示，在2周內(nèi)給予XOS及其與植物乳桿菌S2的組合，選擇性地增加了小鼠糞便樣本中乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，而腸球菌、腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的數(shù)量則明顯減少。在21天的小鼠中，大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量在XOS組或XOS與植物乳桿菌S2組合的組與對(duì)照組之間沒有差異。 （5）體外抗氧化活性 如圖2A所示，與作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的維生素C進(jìn)行比較，XOS、植物乳桿菌S2及其組合都能清除DPPH自由基，且清除效果隨著濃度的增加而增加，XOS和植物乳桿菌S2的最大抑制值分別為65.29%和77.34%，XOS與植物乳桿菌S2組合的DPPH自由基清除活性比單獨(dú)的XOS或植物乳桿菌S2的活性好。 如圖2B所示，XOS、植物乳桿菌S2及其組合的ABTS自由基清除效果隨著濃度的增加而增加，但低于維生素C的活性；在4.0 mg/mL的濃度下，XOS、植物乳桿菌S2及其組合的ABTS自由基清除活性最高，分別為59.38%、65.48%和79.71%；在0.5-4.0 mg/mL的范圍內(nèi)，XOS與植物乳桿菌S2組合顯示出比單獨(dú)的XOS或植物乳桿菌S2的ABTS自由基清除活性強(qiáng)。 如圖2C所示，XOS、植物乳桿菌S2及其組合的金屬螯合活性隨著濃度的增加而增加，但比維生素C的活性要弱；XOS與植物乳桿菌S2結(jié)合顯示出更高的螯合能力，在4.0 mg/mL濃度下，螯合率為86.19%。 以上的結(jié)果表明，從玉米芯中提取的XOS與植物乳桿菌S2相結(jié)合的協(xié)同抗氧化作用，這種組合的抗氧化性能大大優(yōu)于單個(gè)抗氧化效果的總和。
試驗(yàn)結(jié)論 總之，本研究通過體外發(fā)酵方法測(cè)定了玉米芯提取的低聚木糖（XOS）與植物乳桿菌相結(jié)合的體外益生元活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XOS是一種有效的底物，增強(qiáng)了植物乳桿菌S2的抑菌活性；XOS與植物乳桿菌S2聯(lián)合使用可以增加小鼠糞便中的乳酸菌和雙歧桿菌的活性，降低腸球菌、腸桿菌和梭狀芽胞桿菌的活性；且XOS和植物桿菌S2的組合在體外具有顯著的DPPH、ABST自由基清除活性，并且其組合物顯示出比單獨(dú)的XOS或植物乳桿菌S2的抗氧化活性更好，以上結(jié)果表明從玉米芯中提取的XOS是一種潛在的益生元來源，可作為功能食品和營(yíng)養(yǎng)品的成分。
參考資料： Yu Xiuhua, Yin Jianyuan,et al. Prebiotic Potential of Xylooligosaccharides Derived from Corn Cobs and Their In Vitro Antioxidant Activity When Combined with Lactobacillus.[J].Journal of Microbiology & Biotechnology, (2015), 25(7), 1084–1092. |
