試驗設(shè)計 試驗設(shè)計：喂食小鼠添加XOS或標準玉米淀粉作為對照的改良天然1430 Altromin飲食，其量等于碳水化合物部分的10%。 組織學(xué)分析:以盲法對13周齡小鼠的每個胰腺中至少50個胰島和每個唾液腺的8個連續(xù)切片進行胰島炎和涎腺炎評分。 腸道微生物群組成分析：取自4周齡未經(jīng)處理和經(jīng)抗生素處理的給予對照或XOS補充飲食的雌性NOD小鼠的糞便，以及7周齡接受來自對照和XOS喂養(yǎng)NOD小鼠的糞便微生物群移植的NOD小鼠，進行DNA提取、基于標簽編碼的16S rRNA基因擴增子MiSeq測序和測序分析，以及來自糞便和腸系膜淋巴結(jié)的細菌DNA實時定量PCR（qPCR）。 飲食對代謝和葡萄糖耐量的影響：對于OGTT（口服葡萄糖耐量試驗），8周齡的小鼠在口服75 mg/小鼠的葡萄糖之前禁食6 h；測量在葡萄糖挑戰(zhàn)后的0、15、30、60、90和120 min小鼠血糖，以及對小鼠的血清進行循環(huán)胰島素和瘦素水平分析。 SCFA分析：從13周齡的小鼠身上取下結(jié)腸內(nèi)容物，通過氣相色譜法測量SCFA濃度。 胰高血糖素樣肽-1分析：收集13周齡小鼠的血清樣本，使用發(fā)光氧導(dǎo)免疫測定法（LOCI）分析胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的總水平。 腸道通透性：在7周齡的小鼠禁食禁水4 h后，口服600 mg/kg FITC-葡聚糖，進行體內(nèi)腸道滲透性檢測；測量收集自13周齡小鼠血清中的人連蛋白（Zonulin）濃度。 定量PCR的基因表達：13周齡的小鼠被殺死后，對結(jié)腸和回腸片段進行RNA分離和cDNA合成。Muc1、Muc2、Ocln和Tjp1用于評估腸道屏障，Arg1、Tgfβ（也稱為Tgfb1）；Gzmb、Fasl和Cd8a TaqMan基因表達檢測用于巨噬細胞，調(diào)節(jié)性和細胞毒性T細胞相關(guān)基因用于qPCR分析。 流式細胞儀分析XOS飲食的潛在抗炎作用：小鼠在13周齡時被殺死，用抗體混合物對CD3-FITC、NK/NKT-PE、CD8-APC、CD11c-FITC、F4.80-PerCP-CY5.5、CD4-PerCP-CY5.5、forkhead box P3 (FOXP3)-PE和CD69-APC在腸系膜、胰腺淋巴結(jié)和脾臟單細胞懸液中進行染色。 試驗結(jié)果 （1）飲食中的XOS調(diào)節(jié)NOD小鼠的自身免疫表現(xiàn) 如圖1a所示，攝入XOS補充飲食25周后，糖尿病發(fā)病率明顯降低（分別為26%和50%），30周齡時發(fā)病率不再有差異；但與對照飲食相比，XOS喂養(yǎng)小鼠的糖尿病發(fā)病時間明顯推遲（圖1c）；圖1b顯示將XOS和對照組喂養(yǎng)的小鼠的糞便微生物群移植到安置在無菌隔離器中經(jīng)抗生素處理的NOD小鼠的幼崽身上，并不足以轉(zhuǎn)移糖尿病發(fā)病的延遲；對胰腺和唾液腺進行組織學(xué)分析結(jié)果顯示，低聚木糖（XOS）對唾液腺病灶大小和數(shù)目的影響非常明顯，而對胰腺的影響則較為溫和（圖1d和1e）。
（2）飲食對經(jīng)抗生素處理的小鼠的胰島和唾液腺炎的影響 如圖1e和圖1f所示，經(jīng)抗生素處理的對照飲食小鼠完全發(fā)展為胰腺炎，其程度與未經(jīng)處理的小鼠相同；在斷奶前只喂食補充XOS飲食的小鼠中，胰腺炎輕微下降，而在同時給予抗生素的小鼠中胰腺炎減少的更多；雄性NOD小鼠發(fā)生的胰腺炎比使用抗生素的雌性小鼠要少，但在喂食XOS的補充飲食時更少（圖1g-1h）。 如圖1d所示，當(dāng)評估同一組小鼠的唾液腺炎程度時，發(fā)現(xiàn)生命早期的XOS飲食足以降低生命后期的唾液腺炎評分；用抗生素處理的對照組和XOS喂養(yǎng)的小鼠都出現(xiàn)了與未處理的XOS喂養(yǎng)小鼠相同的低程度唾液腺炎。 如圖2a和2b所示，PCoA在4周齡時由于飲食的原因顯示出明顯的集群（基于未加權(quán)和加權(quán)UniFrac距離矩陣的PERMANOVA：分別為p<0.05，R2=0.15和p<0.05，R2=0.18），這種分離主要是由副桿菌屬以及四個豐度較低（<2%）的屬驅(qū)動的，與對照組小鼠（1%）相比，XOS喂養(yǎng)小鼠的豐度相對較高（12%）（圖2e）。
（3）抗生素減少腸道微生物群 如圖2j所示，通過16S rRNA基因（V3區(qū)域）qPCR發(fā)現(xiàn)抗生素可使16S的總拷貝數(shù)減少4000倍以上；擴增子測序表明飲食組中剩余的少數(shù)細菌主要由鏈球菌屬組成，達到擴增子豐度的98%（±1%）（圖2f）；此外，與對照組（0%）抗生素處理的小鼠相比，只有一個豐度很低的屬即黃桿菌屬，在XOS喂食的小鼠（占剩余微生物組的0.1%）顯著升高（圖2g）；這種低豐度分類群的單一差異是導(dǎo)致兩個飲食組在未加權(quán)PCoA圖中單獨聚類的主要原因：P<0.05, R2= 0.086（圖2c）；因此在加權(quán)PCoA圖中無法觀察到差異：P=0.17，R2= 0.17（圖2d），綜合來看，數(shù)據(jù)表明XOS對胰腺炎有直接的微生物群獨立性影響。 （4）益生元對腸道屏障功能和粘膜炎癥的改善 如圖3a所示，與喂養(yǎng)對照組飲食的小鼠相比，喂養(yǎng)XOS小鼠的屏障滲透性確實較低；圖3c顯示腸系膜淋巴結(jié)中16S rRNA基因的qPCR也證實了這一點，顯示與對照組小鼠相比，喂食XOS的小鼠中能夠穿過腸道屏障并到達引流淋巴結(jié)的微生物較少；如圖3e、3h所示，與黏液相關(guān)的基因在低聚木糖（XOS）組小鼠回腸（Muc2）和結(jié)腸（Muc1）中也表達上調(diào)；圖3i-l顯示，其他屏障相關(guān)基因，如Ocln和Tjp1（分別編碼閉鎖素和緊密連接蛋白1）在早期喂食低聚木糖（XOS）的小鼠回腸和結(jié)腸中均顯著上調(diào)。圖3i-j結(jié)果表明在生命早期補充XOS似乎以獨立于微生物的方式調(diào)節(jié)這些部分的屏障功能，因為這種差異在抗生素處理的小鼠中持續(xù)存在。 如圖3b所示，代表回腸屏障功能的FITC-葡聚糖試驗以及圖3k、3l回腸組織中的基因表達都沒有顯示出抗生素處理小鼠的屏障得到改善；圖3d表明兩個飲食組的血清中該蛋白的水平是相似的。
（5）微生物群介導(dǎo)的粘膜炎癥的飲食變化 如圖4a、4b所示，與對照組小鼠相比，XOS喂養(yǎng)的小鼠在胰腺和腸系膜淋巴結(jié)以及脾臟中的CD8+NKT細胞和細胞毒性CD8+T細胞的水平較低；圖4c-e中，Cd8a、Gzmb和Fasl qPCR也能證實，顯示這些基因的表達在XOS喂養(yǎng)的小鼠中被類似地下調(diào)，但在斷奶時轉(zhuǎn)為對照飲食的小鼠中卻沒有。 如圖4f所示，與對照組小鼠相比，XOS喂養(yǎng)的小鼠局部淋巴結(jié)中活化（CD69+）調(diào)節(jié)性T細胞的比例略高；圖4j顯示在生命早期喂食XOS飲食的小鼠中，Tgfβ基因的表達水平更高，這進一步表明局部環(huán)境更加抗炎；此外，圖4g顯示F4.80+巨噬細胞在局部和全身都被XOS飲食所誘導(dǎo)。然而，圖4 h表明刺激炎癥的典型CD11c+M1巨噬細胞的比例，在XOS喂養(yǎng)的小鼠脾臟中減少了；巨噬細胞數(shù)量的增加可能是由于抗炎的M2巨噬細胞的增加，它們也是TGF-β的主要生產(chǎn)者；圖4i顯示 M2巨噬細胞標志物Arg1（編碼精氨酸酶1）的基因表達也表明了這一點，該標志物在XOS喂養(yǎng)的小鼠中表達水平更高。
如圖5a所示，通過將XOS和對照組喂養(yǎng)的NOD小鼠的脾細胞移植到NOD/SCID小鼠身上，結(jié)果在兩組中移植都誘發(fā)了糖尿病，且XOS組的影響更大；圖5b顯示將移植的XOS和對照組喂養(yǎng)NOD小鼠中的脾細胞在生命早期用抗生素處理，結(jié)果兩組之間的糖尿病發(fā)病率是相似的，這與圖5e、5f中抗生素處理的小鼠中CD8+免疫細胞缺乏差異很對應(yīng)。
試驗結(jié)論 本文研究了益生元低聚木糖（XOS）對NOD小鼠胰島和唾液腺炎癥的影響，并測試了這些是否由腸道微生物群介導(dǎo)，結(jié)果雌性NOD小鼠及其后代在糖尿病發(fā)病前或斷奶前，喂食含有低聚木糖（XOS）的飲食組小鼠的1型糖尿病的發(fā)病顯著推遲，且胰島及唾液腺中的細胞浸潤顯著減少；菌群移植無法轉(zhuǎn)移低聚木糖（XOS）飲食延緩1型糖尿病發(fā)病的保護作用。小鼠經(jīng)抗生素處理后，喂食低聚木糖（XOS）組小鼠及對照組小鼠的唾液腺炎癥無顯著差異，但低聚木糖（XOS）組小鼠的胰島炎癥顯著減少。低聚木糖（XOS）飲食顯著降低了小鼠腸道通透性，并促進M1到M2巨噬細胞的轉(zhuǎn)變，增加活化調(diào)節(jié)性T細胞的豐度。以上結(jié)果表明，益生元 XOS對唾液腺炎癥具有微生物群依賴性的影響，對胰島病理學(xué)具有微生物群獨立性的影響，這些影響伴隨著腸道屏障的改善。
參考資料： Hansen C H F, Larsen C S, Petersson H O , et al. Targeting gut microbiota and barrier function with prebiotics to alleviate autoimmune manifestations in NOD mice[J]. Diabetologia, 2019, 62(4).
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