試驗目的 本研究旨在探討甘露寡糖(MOS)和低聚木糖(XOS)兩種益生元對腸炎沙門氏菌感染雞的盲腸菌群和細胞因子表達的影響。 試驗設計 選取150只新孵商業(yè)肉仔雞，隨機分為5組（每組6個重復，每個重復5只）：(1)NC組：未受感染對照組（無病雞飼喂標準飼糧），(2)PC組：感染對照組（病雞飼喂標準飼糧），(3)XOS組：感染+XOS（病雞飼喂添加有2 g/kg XOS的標準飼糧），(4)MOS組：感染+MOS（病雞飼喂添加有1 g/kg MOS的標準飼糧），(5)VIRG組：感染+維吉尼亞霉素（病雞飼喂添加有16.5 g/t維吉尼亞霉素的標準飼糧）。 試驗共計5d。XOS純度為95%，聚合度(DP)為2~7。 本研究采用從中國獸醫(yī)菌種采集中心獲得的一株具有新生霉素耐藥性的腸炎沙門氏菌(CVCC3378)感染肉雞。QPCR分析用引物如表1所示。
（1）感染后盲腸腸炎沙門氏菌計數(shù) 如圖1所示，取每只肉雞含內容物的盲腸均質，并在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定接種腸炎沙門氏菌的種群數(shù)量。未感染組盲腸未發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌菌落。感染后第1天，各組間無顯著差異。然而，在感染后第3天，與PC組相比，MOS組的雞腸沙門氏菌數(shù)量減少了1.25 log。感染后第5天，MOS組和XOS組腸炎沙門氏菌的平均計數(shù)分別顯著低于PC組1.62和1.01 log。在任何采樣時間，VIRG處理均未顯著影響腸炎沙門氏菌的定殖。
（2）盲腸微生物群落分析 如表2所示，從90份盲腸標本中共獲得16S rRNA V1-V3區(qū)序列955877條。剔除低質量和嵌合序列后，保留843947條序列用于下游分析。每個樣本保留的平均讀數(shù)為9377個(±3094個標準偏差(STD))，所有樣本的中位讀數(shù)長度為482個(±86 STD)堿基。去除低豐度OTUs(<總OTUs 的0.005%)后，還剩下4742個OTUs供進一步分析。通過計算Chao1指數(shù)、PD(整樹)和觀察到的OTU數(shù)量來評估下采樣(4000 reads)OTU表的α多樣性。腸炎沙門氏菌的定殖和飼糧添加均未顯著改變盲腸菌群α多樣性指數(shù)。 為了估計盲腸微生物群落之間的β多樣性，使用了加權和未加權的UniFrac距離矩陣。未加權UniFrac的ANOSIM顯示，飼糧添加和腸炎沙門氏菌感染沒有相關性。相比之下，當考慮類群的相對豐度(加權UniFrac距離矩陣)時，在感染后第3天和第5天，各組之間觀察到顯著(P<0.01)但微弱(0.1<R<0.5)的視覺分離(表3和圖2)。采用LEfSe方法檢測各組間差異最大的受影響類群(LDA>2)組之間。未感染組(NC)瘤胃球菌、糞球菌和毛螺菌科的相對豐度分別為15.8%、20.1%和8.2%，高于PC組(0.5%、0.4%和5%)(圖3A)。 將所有感染組進行比較，LEFSe顯示，飼喂XOS的肉雞中乳酸菌屬(30% vs 10%)、薔薇菌屬(0.15% vs 0.04%)和梭狀芽孢菌屬(0.32% vs 0.07%)增加，而飼喂MOS的肉雞中瘤胃球菌屬(3% vs 0.5%)、糞球菌屬(0.9% vs 0.01%)和腸球菌屬(2% vs 0.02%)物種增加(圖3B)。VIRG處理不影響盲腸細菌群的相對豐度。
（3）盲腸集合淋巴樣組織細胞因子基因表達 如圖4所示，為了確定腸炎沙門氏菌感染或飼糧處理是否改變了腸道免疫功能，我們使用qPCR方法評估了各種炎癥相關細胞因子的基因表達。接種PBS或腸炎沙門氏菌一天后，NC對照組的白介素6 (IL-6)、脂多糖誘導腫瘤壞死因子α因子(LITAF)、干擾素(IFN)-γ和轉化生長因子(TGF)-β的相對表達顯著低于PC對照組(圖4A)。在感染后1天，與PC組相比，飼喂XOS、MOS或VIRG顯著降低了促炎細胞因子、IL-6和LITAF的表達(圖4A)；同時，IL-10在VIRG中表達明顯增加，而XOS組表達減少。在感染后1天和3天，與PC組相比，MOS處理(而非XOS)顯著降低了IFN-γ的表達(圖4A和B)。感染后第3天，與IFN-γ相似，LITAF的相對表達量在MOS組中降低，而在XOS組中沒有降低(圖4B)。腸炎沙門氏菌感染后第3、5天，飼糧添加組間IL-6、IL-10、TGF-β表達水平無顯著變化(圖4B、C)。
（4）盲腸微生物群落結構與炎癥反應的多因素分析 為了進一步研究盲腸菌群與宿主免疫應答之間的相互作用，我們采用CCA方法，在屬水平上研究細胞因子基因(IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ和TGF-β)相對表達與盲腸細菌組成之間的多元結構。DCA的結果表明，采用CCA的單峰模型是直接梯度分析的合適排序方法。CCA結果顯示，不同組盲腸樣本中宿主盲腸炎癥反應(IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ、TGF-β)與細菌組成均有較強相關性(表4、圖5)。IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ和TGF-β的相對表達量與細菌組成在屬水平上一致。IL-10的作用最顯著，其次是IFN-γ、IL- 6、LITAF和TGF-β基因。蒙特卡羅排列檢驗表明，宿主盲腸炎癥反應與細菌組成在屬水平上存在顯著相關(P=0.032)。
試驗結論 綜上所述， XOS益生元降低了病原菌的盲腸定植和炎癥細胞因子的產(chǎn)生，對雛雞腸炎沙門氏菌具有保護作用。
參考文獻： Mohsen·Pourabedin/Pourabedin M;Qiaoling·Chen/Chen Q;MingMing·Yang/Yang M;Xin·Zhao/Zhao X.Mannan- and xylooligosaccharides modulate caecal microbiota and expression of inflammatory-related cytokines and reduce caecal Salmonella Enteritidis colonisation in young chickens.[J].FEMS microbiology ecology,2017,Vol.93(1). |
