試驗設(shè)計 原料：乳雙歧桿菌MN-Gup；低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、菊粉純度均為85%~90%，低聚甘露糖。 益生菌增殖活性的測定：將保存的乳雙歧桿菌MN-Gup菌株在無菌條件下接種到MRS完全培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)活化24 h，然后再接種到MRS完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)活化24 h，重復(fù)以上步驟活化3代，待菌種充分恢復(fù)活力后，取含有10 mL MRS培養(yǎng)基的試管接種MN-Gup活化菌液，接種后使樣品中菌液濃度為1×108 cfu/mL，然后分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖和菊粉，設(shè)定添加1.5%葡萄糖和無碳源培養(yǎng)基為對照組，厭氧培養(yǎng)24 h，用益生指數(shù)（PI）來表示每種益生元的益生活性。 腸道微生態(tài)體外模擬模型的建立：配制結(jié)腸模擬發(fā)酵液，按質(zhì)量比分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、低聚果糖、低聚甘露糖和葡萄糖，混勻后滅菌備用。 取3名成年人糞便稱重，混合后按1:5質(zhì)量比用生理鹽水進(jìn)行稀釋，漩渦震蕩，經(jīng)500 g離心5 min去除大的沉淀物，得菌群懸液，按8:1:1體積比依次添加結(jié)腸發(fā)酵液、菌群懸液和MN-Gup菌體懸液，使每組MN-Gup終濃度為1×108 cfu/mL，然后以搖床37℃、轉(zhuǎn)速90厭氧培養(yǎng)8 h，按DNA提取試劑盒操作步驟提取發(fā)酵液總DNA，并測定其DNA濃度。 腸道菌群增殖測定：按表1所示設(shè)計引物，取合成的擬桿菌屬（Bacteroidetes）、厚壁菌屬（Firmicutes）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp）、乳桿菌屬（Lactobacillus spp）和阿克曼菌屬（Akkermansia muciniphila）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，按10倍比例稀釋為8個點，按1 μL模板、上下游引物0.5 μL、8 μL水、10 μL SYBR酶配制成20 μL/孔的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以CQ值為縱坐標(biāo)、模板DNA濃度的Lg值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。相同條件下，根據(jù)下列公式計算樣品中目標(biāo)菌群的比例。
試驗結(jié)果 （1）不同益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup增殖活性的影響 由圖1可知，低聚半乳糖具有更顯著的促增殖活性，其PI值為2.18±0.19，其次為低聚木糖，其PI值為1.68±0.15，低聚果糖和低聚甘露糖促增殖活性最低。
（2）不同乳雙歧桿菌合生元組合對腸道益生菌生長的影響 由圖2可知，通過比較乳雙歧桿菌MN-Gup搭配不同益生元組合對糞便菌群中益生菌的影響發(fā)現(xiàn)，低聚木糖組合促雙歧作用顯著高于其他益生元，其對雙歧桿菌增殖的促進(jìn)效果是低聚半乳糖的6倍。即在體外模擬腸道微生態(tài)體系下，低聚木糖更適宜作為MN-Gup的合生元來調(diào)節(jié)腸道雙歧桿菌，而低聚半乳糖組則顯著提高了乳桿菌比例。 本試驗比較單一益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup的益生效果時發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖促增殖最強，而在菌群中低聚木糖對雙歧菌屬的益生效果似乎更顯著。這可能是因為菌群中其他種類的雙歧桿菌對低聚木糖的利用率更高，具體原因需要進(jìn)一步分析。這也從側(cè)面反映出了多菌群體系下研究益生元的益生功能與單菌株發(fā)酵體系是可能存在差異的，相比較而言腸道微生態(tài)模擬體系可能更接近合生元在體內(nèi)作用時的真實環(huán)境。
（3）不同乳雙歧桿菌合生元組合對腸道厚壁/擬桿菌群比例、阿克曼菌（AKK）生長的影響 由圖3可知，各合生元組對AKK菌群占比的影響不大，表明這5種低聚糖組合并不會顯著影響AKK菌群的比例；與葡萄糖對照組相比，各合生元組均顯著增加了厚壁/擬桿菌群的比值。
試驗結(jié)論 本研究設(shè)計了基于體外腸道微生態(tài)模擬方法的益生元篩選方法，通過提取成年人糞便菌群后進(jìn)行體外發(fā)酵，研究比較了不同合生元組合對腸道有益菌和重要菌群的調(diào)控作用，并與單菌株發(fā)酵體系的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低聚木糖與乳雙歧桿菌MN-Gup組合后可顯著提升菌群中雙歧桿菌的比例，而單菌株發(fā)酵體系下低聚半乳糖更能促進(jìn)MN-Gup的生長；各合生元組合對阿克曼菌的比例并無顯著影響。
參考資料： 李樹森,肖然,孫二娜,任怡鎂,王辰元.基于體外模擬腸道微生態(tài)系統(tǒng)的乳雙歧桿菌MN-Gup益生元篩選及其發(fā)酵特性研究[J].中國奶牛,2022(08):1-4. |
