試驗設計 試驗設計：以C57BL/6為背景的野生型（WT）和Il10-/-小鼠（8周齡）作為研究對象，將雄性野生型（WT）小鼠被分配到WT組，Il10-/-小鼠被分別分配到白細胞介素-10基因缺陷（IL-KO）組和XOS組，每組有6-8只8周齡的小鼠，XOS組的小鼠接受1.0g/kg/天的95% XOS（由河南益常青生物科技有限公司提供）灌胃，持續(xù)4周后，將小鼠安樂死，收集其組織。 結腸炎的評估：XOS干預期間，每周測量小鼠體重和疾病活動指數(shù)（DAI）的變化；收集結腸組織，用尺子測量；對用蘇木精和伊紅（H&E）染色的結腸標本進行組織學評分，每只小鼠0-4分，所有評分納入相應組的統(tǒng)計。 生化指標測定：測定結腸組織中的髓過氧化物酶活性、血清細胞因子IL-6、C-反應蛋白（CRP）和紅細胞沉降率（ESR）；測量TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-17A的結腸信使RNA水平。 評價粘液細菌的滲透：基于每個樣品的整個腸道橫截面的觀察，使用熒光原位雜交法對DNA染色的切片進行盲評的，分數(shù)0-4；統(tǒng)計結腸隱窩中的細菌數(shù)量；測量結腸黏液的厚度。 杯狀細胞的數(shù)量以及膜腔面積的測定：計算杯狀細胞的數(shù)量；測量小泡細胞的粘液填充面積。 免疫印跡：將結腸組織均質化，在4℃下以15000轉/分的速度離心15分鐘，使用ImageJ軟件進行量化，結果與GAPDH歸一化，并以目標蛋白表達/GAPDH表達比率計算。 肝臟和腎臟功能的測定：測定小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、肌酐和尿素氮。 試驗結果 （1）XOS干預改善了Il10-/-小鼠的自發(fā)性結腸炎 如圖1A-C所示，WT組和IL-10-KO組的小鼠體重差異從第2周開始升高，在第4周有顯著差異；測量小鼠結腸組織發(fā)現(xiàn)IL-10-KO組小鼠結腸明顯縮短，4周的XOS干預改善了生長緩慢和結腸縮短的情況；圖1D顯示，在DAI方面，Il10-/-小鼠的得分隨著時間的推移逐漸增加，且與WT小鼠相比更高，表明有明顯的結腸炎；圖1E顯示，組織學上，Il10-/-小鼠出現(xiàn)了明顯的腸道炎癥，粘膜上有零星的免疫細胞堆積，腸腺結構受損；圖1F顯示，Il10-/-小鼠的炎癥評分明顯高于WT小鼠，XOS組的Il10-/-小鼠有明顯的輕度結腸炎癥，炎癥評分較低，并伴有少量的炎癥細胞浸潤和腺體結構損傷。
（2）XOS干預改善了中性粒細胞浸潤和細胞因子表達 如圖2A所示，與WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的MPO濃度更高，XOS干預后MPO濃度顯著降低；圖2B-E顯示，與IL-10-KO組相比，XOS組小鼠的TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-17A的表達水平更低；圖2F-H顯示， Il10-/小鼠血液中的IL-6、ESR和CRP水平在第8周至第12周顯著增加，而在XOS干預組中增加不明顯。
（3）XOS干預改善了Il10-/-小鼠的粘液細菌滲透情況 如圖3A所示，在WT小鼠中，細菌處于在內層粘液層之外，微生物群在內層粘液層和腔內糞便內容物之間形成一個線性結構夾層；Il10-/-小鼠的細菌與上皮細胞直接接觸，其中一些細菌位于隱窩深處，這表明細菌的滲透發(fā)生在腸結腸炎發(fā)生的早期，在XOS的干預下，細菌的滲透得到了明顯的改善；圖3B-D的結果顯示，與WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的隱窩表面和底部有更多的細菌定植，而XOS干預可以減少細菌的定植。
（4）XOS干預調節(jié)了Il10-/-小鼠的粘液屏障 如圖4A和圖4B所示，三組中所有小鼠的粘液層和杯狀細胞的厚度相似；圖4C結果顯示，在Il10-/-小鼠中，粘液填充的杯狀細胞膜面積減少；圖4D對WT小鼠組織的評估顯示，上皮細胞表面有明顯的粉紅色染色（中性碳水化合物）（可能是分泌的粘液蛋白），而杯狀細胞內有明顯的藍色染色（酸性碳水化合物），相反，Il10-/-小鼠的組織顯示出粘蛋白染色的顯著變化，整個組織呈深藍色/紫色，表明中性和酸性粘蛋白的分布和表達模式發(fā)生了變化。以上說明XOS的作用不僅影響了杯狀細胞的數(shù)量，而且還顯著改善了粘液填充的杯狀細胞膜面積，且在XOS干預后，WT型小鼠Il10 - / -小鼠的PAS/AB染色變化得到改善。
（5）XOS干預恢復了Il10-/-小鼠的自噬功能 如圖5所示，免疫印跡結果顯示，在Il10-/-小鼠中，LC3-II蛋白和LC3-II/I的表達都明顯減少，p62和beclin-1的表達增加。經XOS處理后的Il10-/-小鼠恢復了上述變化，說明XOS干預恢復了Il10-/-小鼠的自噬功能。
（6）XOS干預的安全性 如圖6所示，小鼠每天口服灌胃1.0g/kg 95% XOS耐受性良好，沒有觀察到明顯的宏觀不良反應，每組的肝腎功能在基礎和干預后都沒有明顯的變化。
試驗結論 本文通過研究XOS干預對Il10-/-小鼠（IBD模型）的影響，結果表明XOS干預的Il10-/-小鼠呈現(xiàn)出明顯的輕度自發(fā)性結腸炎，疾病活動指數(shù)、組織學評分和腸道炎癥細胞因子水平較低；飲食中的XOS降低了在腸道結腸炎發(fā)病早期的腸道粘液的細菌滲透率；XOS的作用與結腸中LC3II/I的表達回復和p62及beclin-1的表達減少有關。因此XOS降低了結腸粘液微生物群的滲透，并恢復了自噬的功能，表明XOS可能是一種潛在的膳食補充劑或功能食品，可用于IBD的早期管理。
參考資料： Chen Z, Shen X, Zhou Q; et al. Dietary xylo-oligosaccharide ameliorates colonic mucus microbiota penetration with restored autophagy in interleukin-10 gene-deficient mice.[J].JPEN. Journal of parenteral and enteral nutrition,2021,Vol.46(5): 1130-1140. |
