試驗設計 分別稱取適量低聚木糖與乳清分離蛋白（WPI）分散在去離子水中制備固形物濃度為10%（W/V）的溶液，改變低聚木糖與WPI質量比分別為1:1、1:2、1:3、1:4，在4℃冰箱中充分水合12 h得到溶液。反應前用0.1 mol/LNaOH調節(jié)溶液的pH為8.0，90℃水浴加熱，不同時間分別取樣后迅速冰浴終止反應，所得溶液經冷凍干燥留待后用。取反應過程中 0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min樣品通過冰浴終止反應后測定體系的 pH 值變化；在294 nm處測定WPI和低聚木糖的美拉德反應產物（MRPs）的吸光度，作為非酶促褐變中間產物形成的指標；在420 nm處測定MRPs的吸光度，作為在更高級階段形成棕色聚合物的指標；采用比濁法計算MRPs乳化活性指數（EAI）和乳液穩(wěn)定性指數（ESI）；采用DHR-2流變儀對MRPs的動態(tài)和靜態(tài)流變學性質進行測定。 試驗結果 （1）反應中溶液pH變化 如圖1所示，隨著反應時間的延長，4個體系的pH均呈現下降趨勢。在反應最初的 0.5 h內體系pH迅速下降，此后pH緩慢下降直至反應結束，并且pH從8.01降至7.77~7.51，其中低聚木糖與WPI比例為1:4時，pH變化最小，比例為1:1時變化最大。
（2）UV-Vis吸光度的變化 如圖2a、2b所示，分別為不同比例的反應體系（低聚木糖：WPI）初始時刻和反應2.5 h時在294 nm和420 nm處的吸光度，四種體系反應后在兩種吸光波長處的吸光度都有所增加。從294 nm處吸光度的增加來看，比例為1:2的反應體系增量最大（0.075±0.025）；而比例為1:1的反應體系增量最?。?.030±0.0073），這說明比例為1:2 的體系在反應中產生的酮類和醛類等高活性中間產物最多，而比例為1:1的體系產生的中間產物最少；從420 nm處吸光度的增加來看，比例為1:2的反應體系增量最大（0.076±0.0082），說明該比例下反應產生的類黑素最多，而另外三個比例吸光度的增量無顯著性差異，這與294 nm處結果相對應。類黑素是由上述產物經過環(huán)化、異構化、縮合等反應形成的棕色含氮聚合體，因此類黑素的含量與中間產物的積累量有關，這與本文研究結果一致。
（3）低聚木糖-WPI美拉德產物粒徑分析 如圖3所示，WPI經過濕熱法美拉德反應前，各體系的平均粒徑范圍均在200~450 nm；反應2.5 h后，分子量增大，而平均粒徑減小，各體系的平均粒徑范圍均在80~250 nm，其中比例為1:3的平均粒徑最小為94.88±1.88 nm，比例為1:2的平均粒徑最大為 214.83±4.80 nm。
（4）低聚木糖-WPI美拉德反應產物的乳化性能 如圖 4a、4b所示，分別為不同比例的低聚木糖-WPI體系美拉德反應前后乳化特性的變化，其中濕熱處理前后的WPI 作為對照組。 由圖4a可知，反應前各體系乳化活性（平均為35.65±1.45 m2/g）差異性不顯著，而相較初始體系，經美拉德反應2.5 h的體系乳化活性稍有提高，其中比例為1:3的體系乳化活性最好（乳化活性指數為40.18±1.12 m2/g），比例為1:1的體系乳化活性最差（乳化活性指數為35.80±0.15 m2/g），但與之相反的是，WPI 經熱處理后乳化性反而降低（34.10±0.75m 2 /g）。 由圖4b可知，反應前各體系的乳化穩(wěn)定性范圍為60.06±0.88~42.30±5.88 m2/g，其中低聚木糖-WPI比例為1:1時乳化穩(wěn)定性最大，比例為1:3時最小，這可能是多糖含量不同造成的差異；而美拉德反應后各體系乳化穩(wěn)定性均增加，比例為1:2的乳化穩(wěn)定性最好（65.23%），比例為1:3時最差（56.85%），同時熱處理后的WPI乳化穩(wěn)定性也降低（41.64%±0.77%）。
（5）低聚木糖-WPI美拉德反應產物的流變學性質 如圖5所示，WPI及4種比例低聚木糖-WPI美拉德反應產物的儲能模量G'和損耗模量G''隨溫度和時間的變化曲線。 由圖5a可知，當升溫溫度在25.80~55.29℃時，WPI溶液G''>G'，表現為流體特征，即溶膠狀態(tài)；當溫度在55.78℃時，WPI溶液開始出現G'>G''，在88.64℃時G'的急劇增大，說明在這個階段發(fā)生了溶液-凝膠的轉變，同時在初始的溫度上升階段（溫度范圍約為25~88.64℃），G'和 G''的值都非常?。?lt;1 Pa）。隨后G'始終大于 G''，在90℃下保持30 min期間，可能是熱誘導更多的蛋白質分子聚集，WPI凝膠網絡增強，從而提高了升溫初始形成的弱凝膠彈性。隨著溫度從90℃降至25℃，G'進一步增大，最終達到13000 Pa以上，這種現象表明膠體網絡強度在冷卻過程中逐漸增強，這可能是由于變性蛋白質之間形成了額外的非共價相互作用（如凝膠結構中的分子間氫鍵、范德華力）；在接下來的25℃平衡期間，G'和 G''幾乎沒有進一步的改變，保持相對平行，說明此時已經形成穩(wěn)定的蛋白質凝膠網絡結構。 不同比例的低聚木糖-WPI美拉德反應產物溶液體系的模量隨溫度和時間的變化與 WPI的凝膠形成過程有所不同。在升溫階段中（25~90℃），G'和G''的變化較小，并且該值均小于10 Pa。在90℃下加熱后才觀察到MRPs溶液G'和G''顯著增加，相比WPI曲線（125 s、88.64℃時開始急劇增大）MRPs溶液G'和G''顯著增加的時間和溫度均出現延遲（比例為 1:1、1:2、1:3、1:4 的體系分別在 147 s、154 s、167 s、129s），這種現象可能與低聚木糖的附著導致蛋白質變性溫度升高有關。另一方面，G'和 G''在冷卻過程中繼續(xù)增加，在接下來的 25℃平衡期間G'和 G''值逐漸變得穩(wěn)定，其中比例為1:3的體系G'值高達約 97000Pa（約WPI的7倍），其次是1:2的G'值約為38000 Pa，1:4和1:1的G'值分別為 18000 Pa和13000 Pa。同時整個升溫和降溫過程，G'始終大于G''，表明低聚木糖-WPI美拉德反應產物體系可能在25℃之前就表現出類固體性質。 如圖6所示，分別為WPI和4種比例低聚木糖-WPI美拉德反應產物溶液的流動行為，數據顯示了溶液的表觀粘度隨剪切速率的變化情況。在0.1~100 s-1的剪切速率范圍內，剪切速率不斷升高，5種體系表觀粘度不斷降低，表現出剪切稀化行為，呈現出一種典型的假塑性流體流變特性。此外，在相同剪切速率下，WPI的表觀粘度最小；雖然美拉德反應使得體系表觀粘度增加，但體系中WPI所占比例越大，其假塑性特征越明顯；隨著WPI占比的降低，剪切速率不斷增大，表觀粘度下降逐漸減小。
試驗結論 低聚木糖-WPI質量比為1:2時，體系美拉德反應程度最高，平均粒徑最大，乳化活性和乳化穩(wěn)定性也得到最大程度的提高。此外，本實驗研究了糖基化修飾對WPI凝膠行為的影響，發(fā)現美拉德反應導致了各體系模量不同程度的增加，其中比例為1:3的低聚木糖-WPI美拉德反應產物的粘彈性最強，G'值約為原始WPI的7倍，結果證明美拉德反應可改善WPI的乳化特性和凝膠特性。
參考資料： 廖陽, 胡居吾, 馬永花, 熊華, 趙強. 濕熱條件下低聚木糖-乳清分離蛋白的美拉德反應及產物乳化性與流變性研究[J].現代食品科技,2019,35（12）:20-27+111. |
