 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 微膠囊的制備：以海藻酸鈉、乳清蛋白為壁材，采用擠壓法制備微膠囊，具體方法如下： 將雙歧桿菌接種MRS液體培養(yǎng)基，于37℃厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次后，離心(5000 r/min, 5 min)收集菌泥，用 0.9%生理鹽水洗滌兩次后，重懸于生理鹽水中，使得濃縮菌液維持在109 CFU/mL，采用傾注平板法對(duì)濃縮菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定量的濃縮菌液，加入凍干保護(hù)劑，與2%海藻酸鈉和10%的乳清蛋白按1：1：1 比例混勻成菌懸液，磁力攪拌30 min。采用1mL 注射器逐滴加入2%的氯化鈣中，靜置30 min，生理鹽水洗滌3次，得濕膠囊，將樣品在-80℃中預(yù)凍1 h后，于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，得凍干微膠囊。在濃縮菌液中，加入等量保護(hù)劑直接冷凍干燥后，得凍干菌粉。 含低聚木糖復(fù)配凍干保護(hù)劑的設(shè)計(jì)： 單因素試驗(yàn)：低聚木糖添加量的篩選：分別按照濃縮菌液的0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%加入低聚木糖，充分混勻后進(jìn)行制備凍干微膠囊，并測(cè)定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。 甘油添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎(chǔ)上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的甘油于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測(cè)定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。 谷氨酸鈉添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎(chǔ)上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的谷氨酸鈉于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測(cè)定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。 正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，以雙歧桿菌最終活菌載率為考察指標(biāo)，確定復(fù)配保護(hù)劑的最佳配比。
包埋率、凍干存活率和最終活菌載率計(jì)算：取1 g 濕(凍干)微膠囊于錐形瓶中，加入10 mL無菌PBS緩沖液（pH=7.4），于37℃振蕩1 h，用0.9%滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋, 使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。包埋率、凍干存活率以及最終活菌載率計(jì)算公式如下：
式中N0:原菌懸液總的活菌數(shù)(CFU)；N1:濕膠囊中總的活菌數(shù)(CFU)，每克濕膠囊中的活菌量乘以總的濕膠囊質(zhì)量；N2:凍干微膠囊中總的活菌數(shù)(CFU) ，每克凍干膠囊中的活菌量乘以總的凍干膠囊質(zhì)量。 微膠囊的掃描電子顯微鏡分析：用JSM-6490LV儀器拍攝雙歧桿菌微膠囊掃描電子顯微照片，以未添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊為對(duì)照。 微膠囊在模擬胃液中的耐酸試驗(yàn)：模擬胃液配制：將8.5 g的NaCl和3.0 g的胃蛋白酶懸浮在7.0 mL的濃HCl中，并用蒸餾水稀釋至1 L，使得溶液pH為2.0。分別取1 g添加保護(hù)劑和未添加保護(hù)劑的微膠囊置于錐形瓶中，并加入10 mL的模擬胃液，于37℃下振蕩2 h，分別在0、10、30 min、1、2 h 取樣離心(5000 r/min,5 min)收集微膠囊，并加入10 mL的無菌PBS緩沖液（pH=7.4），于37℃下振蕩1 h, 使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，以初始微膠囊中的活菌數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算其存活率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對(duì)照。 微膠囊在模擬腸液中的釋放試驗(yàn)：模擬腸液的配制：取6.8 g的KH2PO4和10 g的胰蛋白酶溶于適量的蒸餾水中，用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.5±0.1后，稀釋至1 L備用。分別取1 g添加及未添加冷凍保護(hù)劑的微膠囊置于錐形瓶中，隨后加入10 mL的模擬腸液，于37℃恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)3 h，依次在20、40 min、1、2、3 h 取樣，使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，以最大活菌釋放量為基準(zhǔn)，計(jì)算其釋放率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對(duì)照。 微膠囊貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)：將添加及未添加保護(hù)劑的凍干微膠囊分別在4℃和25℃下避光貯存35 d，每隔7 d取1 g樣品，加入10 mL的無菌PBS緩沖液，于37℃下振蕩1 h，使用傾注平板法測(cè)定雙歧桿菌活菌數(shù)，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對(duì)照。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 低聚木糖添加量對(duì)凍干微膠囊活菌載率的影響 如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，低聚木糖可以顯著提高微膠囊的活菌載率，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，達(dá)到最大，為63.4%。適量的低聚木糖加入可以同時(shí)提高微膠囊的包埋效果和雙歧桿菌的抗凍性；然而當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿砍^4%時(shí)，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低；因此選擇2%~6%的低聚木糖添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。
甘油添加量對(duì)凍干微膠囊活菌載率的影響 如圖2所示，保持低聚木糖添加量為4%，隨著甘油量的增加，微膠囊的活菌載率先增高后降低，在添加量為2%時(shí)，達(dá)到最大值，為67.5%；但過多甘油加入，會(huì)使得微膠囊的包埋效果降低，從而減少微膠囊的最終活菌載率；因此選擇1%~3%的甘油添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。
谷氨酸鈉添加量對(duì)凍干微膠囊活菌載率的影響 如圖3所示，保持低聚木糖添加量為4%，當(dāng)谷氨酸鈉添加量為1%時(shí)，谷氨酸鈉可以顯著增強(qiáng)微膠囊的活菌載率；但過多的谷氨酸鈉會(huì)導(dǎo)致單位質(zhì)量微膠囊中菌含量減少，降低微膠囊的包埋率，同時(shí)谷氨酸鈉濃度過高也會(huì)造成胞內(nèi)滲透壓增加，不利于低溫保存。因此，當(dāng)繼續(xù)增加谷氨酸鈉時(shí)，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低；因此為進(jìn)一步研究谷氨酸鈉在復(fù)配保護(hù)劑中的協(xié)同效果，選擇1%~3%的谷氨酸鈉添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。
（2）正交試驗(yàn)結(jié)果 由表2和表3可知，影響微膠囊最終活菌量的因素主要次序是低聚木糖＞谷氨酸鈉＞甘油，其中低聚木糖的P值小于0.05，說明低聚木糖含量對(duì)微膠囊的最終活菌載量具有顯著性影響。根據(jù)K值，確定最佳配方為A2B2C1，即低聚木糖4.0%，甘油2.0%，谷氨酸鈉1.0%。經(jīng)驗(yàn)證，最佳配方下的雙歧桿菌微膠囊包埋率81.5%±0.7%，凍干存活率為88.1%±0.3%。 此時(shí)微膠囊的最終活菌負(fù)載率為71.8%±0.2%，優(yōu)于正交試驗(yàn)表中的結(jié)果，因此認(rèn)為正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果有效。
（3）微膠囊的表觀形態(tài)分析 如圖4所示，微膠囊粒徑大小約為1 mm左右，表面呈皺縮塌陷，凹凸不平的現(xiàn)象。添加4%低聚木糖保護(hù)劑的微膠囊（圖 b）相對(duì)于對(duì)照組（圖 a），表面孔徑較少，沒有明顯的裂縫。由于復(fù)配保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果更佳，可以更有效的減緩凍干過程中冰晶的升華，因此添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊（圖 c）更加圓潤包滿，且表面平整致密。
（4）微膠囊在模擬胃液中的耐酸性能 如圖5所示，未包埋的益生菌粉經(jīng)模擬胃液處理2 h后，菌體幾乎全部死亡，而經(jīng)包埋的益生菌下降了49.4%，說明益生菌微膠囊化可以有效抵抗胃酸等不良環(huán)境。此外，添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊經(jīng)模擬胃液處理2 h后，其活菌數(shù)只下降了34.1%，說明保護(hù)劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的耐酸性。此外，谷氨酸鈉的添加也會(huì)誘導(dǎo)某些與菌體生物膜及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生改變, 從而有利于在在酸性環(huán)境中生存。
（5）微膠囊在模擬腸液中的釋放性能 如圖6所示，經(jīng)包埋的益生菌微膠囊具有一定緩釋作用，在60 min幾乎全部釋放，其活菌數(shù)約108 CFU/mL，其中添加含低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊在前60 min的釋放量高于未添加的微膠囊；原因可能是添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊，活菌載量更高，而且低聚木糖作為功能性益生元，可以充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)刺激促進(jìn)雙歧桿菌的生長。因此添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊能夠較好地在人工腸液中崩解，并且達(dá)到益生元和益生菌的協(xié)同作用。
（6）微膠囊的儲(chǔ)存性能 由圖7和圖8可知，在4℃和25℃貯藏一定時(shí)間后，經(jīng)微膠囊化的益生菌存活率顯著高于凍干菌粉(P＜0.05)，說明微膠囊技術(shù)提高了雙歧桿菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。微膠囊壁材可以作為物理屏障，阻隔空氣中氧和水分等不良因素，增強(qiáng)雙歧桿菌的抵抗能力。添加低聚木糖復(fù)配劑的微膠囊，在4℃和25℃下貯藏35 d后，活菌量分別為8.1和7.0 lg CFU/g，相對(duì)未添加保護(hù)劑的微膠囊儲(chǔ)藏性更好，且符合《益生菌類保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)》，原因可能是復(fù)配保護(hù)劑中低聚木糖和谷氨酸鈉具有一定還原性，可以更有效減少菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化, 維持雙歧桿菌的穩(wěn)定性。
試驗(yàn)結(jié)論 以海藻酸鈉和乳清蛋白為壁材制備的雙歧桿菌微膠囊中，添加以低聚木糖復(fù)配的凍干保護(hù)劑可以提高凍干微膠囊的活菌載率，最佳配方為低聚木糖4.0%、甘油2.0%、谷氨酸鈉1.0%，此時(shí)微膠囊的活菌載率為 71.8%±0.2%，與未添加組相比提高了約 21.6%；添加以低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊表面更佳平整致密，經(jīng)模擬胃液處理2 h 后，活菌量相對(duì)于對(duì)照組提高了約15.3%，同時(shí)在腸液中前60 min的釋放率也顯著高于未添加組。經(jīng) 4℃和25℃儲(chǔ)藏35 d后, 加入保護(hù)劑的微膠囊活菌量相比與未添加組分別提高了約0.41 lg CFU/g和0.42 lg CFU/g。因此，低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的胃液耐酸性、腸液釋放性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。
參考資料： 張傳偉,朱慧霞,柴佳太,彭洪草,姚日生.低聚木糖復(fù)配凍干保護(hù)劑的優(yōu)化及其對(duì)雙歧桿菌微膠囊性能的影響[J/OL].食品工業(yè)科技:1-13. |
