試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)樣品：Plexus Worldwide（Scottsdale，USA）提供了Slim，以每天1594 mg的劑量進(jìn)行測(cè)試，其中包含1000 mg的益生元XOS和531 mg的多酚混合物，其中包含500 mg的綠咖啡提取物（至少含50％的羥基檸檬酸），藤黃果提取物20毫克（含50％檸檬酸），α-硫辛酸10毫克和桑葚果實(shí)提取物1毫克。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： （1）短期結(jié)腸培養(yǎng)：以5位不同健康人類的糞便（供體A：女性，27歲；B：女性，24歲；C：男性，21歲；D：男性，32歲；E：男性，24歲）作為供體。在結(jié)腸培養(yǎng)開始時(shí)，將試驗(yàn)樣品（0mg或1594mg）加入到無糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得到的最終濃度分別為0g/L（空白對(duì)照）或2.66g/L（Slim）；之后通過將新鮮采集的糞便樣本與厭氧磷酸鹽緩沖液以1:5（m:v）的比例混合，為不同的人類志愿者制備糞便接種液，然后均質(zhì)化10分鐘并通過離心去除大顆粒（2分鐘，500克）后，將糞便接種物（1:10）分別加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，溫度為37℃，持續(xù)搖晃（90rpm），所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。 （2）人類腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器（SHIME®）：SHIME由五個(gè)反應(yīng)器組成，這些反應(yīng)器模擬了人體胃腸道的不同部分：胃，小腸和三個(gè)結(jié)腸區(qū)域。在接種健康人類志愿者（男性，32歲）的糞便微生物群后，結(jié)腸隔室模擬升結(jié)腸（AC），橫結(jié)腸（TC）和降結(jié)腸（DC）。SHIME運(yùn)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)置包括兩個(gè)星期的啟動(dòng)期，兩個(gè)星期的對(duì)照期和三個(gè)星期的干預(yù)期，在干預(yù)期間，每天將1594 mg/d劑量的試驗(yàn)樣品與食物一起服用。 檢測(cè)指標(biāo)：短期結(jié)腸培養(yǎng)，在結(jié)腸培養(yǎng)0h和48h后進(jìn)行pH、氣體、SCFA和乳酸（LA）測(cè)量；SHIME實(shí)驗(yàn)期間，每周收集三次微生物代謝活動(dòng)的樣本，并對(duì)微生物群落進(jìn)行分析，同時(shí)檢測(cè)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型中對(duì)宿主細(xì)胞的影響。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）供體選擇 由表1可知，5個(gè)供體產(chǎn)生的氣體、乳酸和SCFA（其中包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽）含量增加，pH值和支鏈SCFA降低；此外，由于在不同的供體中測(cè)試產(chǎn)品發(fā)酵后觀察到的趨勢(shì)相似，因此選擇了具有高代謝活性的供體D作為長期的SHIME實(shí)驗(yàn)。
（2）微生物代謝活性分析 由圖1可知，試驗(yàn)樣品干預(yù)后AC、TC和DC的堿消耗量增加，分別為7.44（±3.19）、4.86（±4.17）和1.98（±1.38）mL/day；試驗(yàn)樣品導(dǎo)致所有結(jié)腸區(qū)域的乙酸產(chǎn)生增加，其中對(duì)升結(jié)腸的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），即增加2.7mM（+13%）；此外，丙酸在三個(gè)結(jié)腸區(qū)域都有增加（p < 0.001），即在AC、TC和DC中分別增加了2.1mM（+19%）、3.4mM（+24%）和4.1mM（+30%）；AC和TC中的丁酸鹽產(chǎn)量顯著增加（P<0.01），其中AC中的丁酸鹽影響最為顯著（+7mM（+84%））。
由圖2可知，試驗(yàn)樣品的干預(yù)對(duì)整個(gè)模擬結(jié)腸中的乳酸產(chǎn)生有輕微影響。在AC（+0.35 mM）中觀察到顯著的乳酸積累，而在TC和DC中乳酸水平保持不變。
（3）微生物群落組成分析 由表2可知，為了評(píng)估試驗(yàn)樣品對(duì)相關(guān)分類群（雙歧桿菌、乳酸菌、嗜粘蛋白-阿克曼菌、擬桿菌和厚壁菌門）的影響，對(duì)腔內(nèi)微生物群進(jìn)行了qPCR分析。在干預(yù)期間，AC和TC的腔內(nèi)環(huán)境中的嗜粘蛋白-阿克曼菌含量增加（AC中從定量限以下到7.15 log/mL，TC中平均為+0.5 log/mL）；干預(yù)的第二周和第三周，在AC中其水平升高，而在干預(yù)的第一周，TC中觀察到直接的干預(yù)效果（+0.75 log（或+ 8％））。 試驗(yàn)樣品干預(yù)后，在AC的腔內(nèi)環(huán)境中，厚壁菌門和擬桿菌門大幅增加，特別是在干預(yù)的第二周和第三周（兩個(gè)門至少+1.5 log/mL（+15%）；腔內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門水平在TC和DC中不受影響。 經(jīng)過適應(yīng)期后，在干預(yù)的第二和第三周，乳酸菌和雙歧桿菌在AC的腔內(nèi)受到刺激（兩個(gè)菌屬都超過了+2.5 log/mL（>30%））；在TC中也觀察到乳酸菌屬的腔內(nèi)增加，但沒有AC中那么明顯（+0.4 log/mL）。如圖3所示，腔內(nèi)乳酸菌群落主要由與三個(gè)不同物種有關(guān)的操作分類單位（OTU）主導(dǎo)，即植物乳桿菌、Lactobacillus oris和Lactobacillus antri；在干預(yù)期間，植物乳桿菌在三個(gè)結(jié)腸區(qū)域的相對(duì)豐度趨向于增加到19-33%
（4）對(duì)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型中宿主細(xì)胞的影響 如圖4a所示，通過測(cè)量Caco-2細(xì)胞的TEER作為腸道屏障功能的量度，所有的產(chǎn)品都能保持TEER值接近100%；采用試驗(yàn)樣品干預(yù)后，TC的TEER趨于增加（+9.7%），DC的TEER也有顯著的增加（+18.5%）。此外，如圖4h所示，與各自的對(duì)照組相比，在TC和DC中的干預(yù)期之后，LPS誘導(dǎo)的THP1巨噬細(xì)胞的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性更加明顯。如圖4b-4g所示，在細(xì)胞因子水平方面，TC和DC中干預(yù)期后LPS誘導(dǎo)的IL-10和IL-6顯著增加（即IL6，TC+2.5倍，在DC中+3.2倍；IL10，在TC中+2.3倍，在DC中+2.7倍）；與相應(yīng)的對(duì)照組相比，試驗(yàn)樣品干預(yù)可誘導(dǎo)較少的IL-1β（在TC和DC中）和較多的IL-8（僅在TC中顯著），并增加DC中的CXCL10水平；然而相比于對(duì)照產(chǎn)品，TNF-α在AC中觀察到減少，而在TC和DC中觀察到增加。
試驗(yàn)結(jié)論 采用經(jīng)驗(yàn)證的體外腸道模型（即SHIME®模型），結(jié)合上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)，研究長期服用低聚木糖/多酚混合物的益生元潛力和免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該混合物沿整個(gè)結(jié)腸良好發(fā)酵，導(dǎo)致升結(jié)腸中丁酸鹽（+7 mmol/L）的產(chǎn)生增加；橫結(jié)腸中乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的產(chǎn)生增加（每種大約+4 mmol/L）；降結(jié)腸中丙酸鹽的產(chǎn)生也增加（+4.1 mmol/L）；升結(jié)腸中銨減少和乳酸水平升高，這與乳酸桿菌和雙歧桿菌的增加相關(guān)（+2.5 Log/mL）。此外，近端結(jié)腸管腔中產(chǎn)丙酸的嗜粘蛋白-阿克曼菌增加（高達(dá)7.15log/mL）；同時(shí)觀察到對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸的Caco-2屏障功能有保護(hù)作用，并有明顯的免疫激活特性 。
參考資料： Van, den, Abbeele, et al. A combination of xylooligosaccharides and a polyphenol blend affect microbial composition and activity in the distal colon exerting immunomodulating properties on human cells[J]. Journal of Functional Foods, 2018. |
